Un mecanismo de retroalimentación desadaptativo entre la matriz extracelular y el citoesqueleto contribuye a la fisiopatología de la miocardiopatía hipertrófica

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 4 (2023) Citar este artículo

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La miocardiopatía hipertrófica es un trastorno hereditario debido a mutaciones en las proteínas contráctiles que produce un miocardio rígido e hipercontráctil. Para comprender el papel de la rigidez cardíaca en la progresión de la enfermedad, aquí creamos un modelo in vitro de miocardiopatía hipertrófica utilizando tecnología de hidrogel. El cultivo de miocitos cardíacos de tipo salvaje en hidrogeles con un módulo de Young (rigidez) que imita el miocardio con miocardiopatía hipertrófica es suficiente para inducir un estado mitocondrial hipermetabólico en comparación con los miocitos colocados en hidrogeles que simulan un miocardio sano. Significativamente, estos datos reflejan los de los miocitos aislados de un modelo murino de miocardiopatía hipertrófica humana (cTnI-G203S). Por el contrario, la función mitocondrial de los miocitos cTnI-G203S se restablece por completo cuando se colocan en placas de hidrogeles que imitan el miocardio sano. Identificamos un mecanismo de retroalimentación mecanosensor entre la matriz extracelular y la red citoesquelética que regula la función mitocondrial en condiciones saludables, pero participa en la progresión de la fisiopatología de la miocardiopatía hipertrófica resultante de mutaciones del gen sarcomérico. Es importante destacar que identificamos sitios clave de "enlazador" en este esquema que pueden representar posibles objetivos terapéuticos.

La miocardiopatía hipertrófica (MCH) es una enfermedad cardíaca genética autosómica dominante que afecta a 1:500 de la población general1. Es la principal causa de muerte súbita cardíaca en jóvenes (entre 5 y 15 años)2. La MCH se produce predominantemente debido a mutaciones genéticas en proteínas sarcoméricas3,4. Las características clínicas de la MCH incluyen hipertrofia ventricular izquierda en ausencia de aumento de la carga de trabajo hemodinámica y un ventrículo izquierdo no dilatado con fracción de eyección conservada o aumentada1,4. A nivel celular, la MCH se caracteriza por remodelación de los miocitos cardíacos, desorganización de las proteínas sarcoméricas, fibrosis intersticial y alteración del metabolismo energético5. Anteriormente hemos identificado un papel para el canal de calcio cardíaco tipo L (LTCC) en el desarrollo de la fisiopatología de la MCH6,7.

El LTCC cardíaco desencadena la “liberación de calcio inducida por calcio”, que es fundamental para mantener el acoplamiento entre excitación y contracción cardíaca8. El LTCC cardíaco también desempeña un papel importante en la regulación de la función mitocondrial a través de mecanismos tanto dependientes como independientes del calcio9,10. Específicamente, la activación del LTCC provoca un aumento del potencial de membrana mitocondrial (Ψm), en presencia o ausencia de calcio9. Esto se ve facilitado por una asociación estructural-funcional entre el canal y las mitocondrias. El LTCC cardíaco es una proteína transmembrana compuesta por subunidades α1C, α2δ y β2. La subunidad β2 está unida a la subunidad α1C formadora de poros a través del dominio de interacción α (AID)11. La subunidad β2 también se asocia con la proteína AHNAK asociada a la diferenciación de neuroblastos, también conocida como desmoyocina, una proteína subsarcolémica grande, que también está anclada a la actina F12. Las proteínas citoesqueléticas, incluida la actina F, interactúan directamente con las mitocondrias uniéndose a las proteínas de acoplamiento mitocondriales externas13,14,15. Este vínculo estructural entre LTCC y las mitocondrias juega un papel importante en la regulación de la función mitocondrial en condiciones fisiológicas, con cambios conformacionales que ocurren en la subunidad β2 de LTCC latido a latido, lo que conduce a alteraciones posteriores en la función mitocondrial9.

Las alteraciones de esta red intracelular están asociadas con la desregulación de la función mitocondrial y el desarrollo de estados patológicos6,7,16,17. Anteriormente hemos demostrado que un modelo murino de HCM humana que causa la mutación del gen de la troponina I (cTnI) Gly203Ser (cTnI-G203S) exhibe una arquitectura citoesquelética alterada, una comunicación estructural-funcional deteriorada entre el LTCC y las mitocondrias, y un estado mitocondrial hipermetabólico resultante6,17 . Se han registrado hallazgos similares en ratones portadores de la enfermedad humana que causa la mutación de la cadena pesada de β-miosina Arg403Gln7. En particular, estas respuestas precedieron al desarrollo del estado hipertrófico.

El fenotipo humano establecido de MCH se caracteriza por un miocardio rígido18,19. En consonancia con esto, el aumento de la síntesis de proteínas de la matriz extracelular (MEC) se ha implicado en la progresión de la patología de la MCH humana20,21,22. De hecho, los tejidos cardíacos diseñados mediante la siembra de miocitos cardíacos sanos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos en tiras de miocardio descelularizado extraído de un modelo porcino de MCH exhiben una mayor rigidez21. La ECM interactúa con los miocitos cardíacos a través de la proteína integrina mecanosensora transmembrana, que también se ha implicado en el desarrollo de la hipertrofia cardíaca23,24. La proteína citosólica vinculina media la unión de la integrina a la actina F y transfiere fuerzas mecánicas desde la membrana celular al citoesqueleto23,25,26. Por lo tanto, además de una red intracelular entre el LTCC y las mitocondrias, también parece existir una asociación estructural-funcional entre la ECM y la actina F. Aquí exploramos el papel de este vínculo en el desarrollo de la fisiopatología de la MCH que involucra el LTCC y las mitocondrias mediante la creación de una plataforma in vitro que imita la rigidez del miocardio de la MCH.

Buscamos desarrollar un modelo in vitro de miocardiopatía hipertrófica. Comenzamos evaluando los módulos de Young (rigidez) de compresión de los hidrogeles producidos para imitar el miocardio sano ("blando") y HCM ("rígido"). Utilizando microscopía de fuerza atómica, la rigidez a la compresión general de los hidrogeles se registró en 12,5 ± 0,4 y 34,1 ± 0,9 kPa respectivamente (p <0,05, Fig. 1b). Luego utilizamos una línea celular de mioblastos H9C2 aislada de tejido ventricular de rata para probar nuestra plataforma in vitro. Las células H9C2 se sembraron en sustratos de hidrogel recubiertos con proteína laminina ECM. Las células H9C2 colocadas sobre hidrogeles rígidos mostraron un aumento significativo en la rigidez a la compresión en comparación con los hidrogeles blandos (p <0,05, figura complementaria 1a). Además, los estudios de inmunohistoquímica revelaron un aumento significativo en la lámina A, un marcador celular de rigidez, así como en la proteína vinculina mecanosensible (p <0,05, figuras complementarias 1b-e)27,28,29. Estos datos indican que alterar la rigidez a la compresión de la plataforma de hidrogel fue suficiente para alterar la rigidez de las células.

a Esquema que indica el vínculo estructural-funcional entre el canal de calcio tipo L, la red citoesquelética y las mitocondrias en miocitos cardíacos naturales. Sitios enlazadores dirigidos (1) dominio de interacción α (AID) del canal de calcio tipo L, (2) sitio de interacción entre la subunidad β2 del canal de calcio tipo L y AHNAK, (3) actina F, (4) β-tubulina, y (5) integrina β1. b Rigidez a la compresión (en kPa) de hidrogeles de poliacrilamida (PA) en condiciones de fabricación (blandas y rígidas), incluida la media ± SEM. c Rigidez a la compresión (en kPa) de miocitos cardíacos puros colocados sobre hidrogeles blandos y rígidos, incluida la media ± SEM. Imágenes representativas y puntos de datos cuantificados para miocitos cardíacos wt sembrados en hidrogeles blandos y rígidos teñidos para lámina A (d, e), vinculina (f, g) e integrina (h, i), incluida la media ± SEM. n = número de células, N = número de hidrogeles. Significancia estadística determinada mediante pruebas de Mann Whitney.

A continuación, realizamos estudios en miocitos cardíacos aislados de ratones de tipo salvaje (wt) de 10 a 15 semanas de edad. Los miocitos colocados sobre sustratos de hidrogel rígidos y blandos recubiertos con laminina produjeron una rigidez de aproximadamente 2 y 4 kPa respectivamente (p <0,05, Fig. 1c). Es importante destacar que estos valores se alinean con mediciones previamente informadas de rigidez miocárdica evaluadas en adultos sanos y con MCH de 20 a 40 años de edad18. Los miocitos colocados en hidrogeles rígidos también mostraron un aumento significativo en la lámina A, vinculina e integrina β1, la isoforma de integrina expresada con mayor abundancia en el corazón posnatal23,30 (p <0,05, Fig. 1d-i). Estos datos indican que nuestra plataforma in vitro es adecuadamente representativa de la condición humana.

Anteriormente hemos demostrado que los miocitos cardíacos cTnI-G203S exhiben una mayor actividad metabólica mitocondrial y Ψm que es consistente con la condición humana31, en respuesta a la activación del LTCC6,17. Aquí, exploramos si simplemente colocar miocitos cardíacos en hidrogeles con una rigidez que imitara el miocardio HCM era suficiente para reflejar estas respuestas. Probamos el efecto de la rigidez del sustrato sobre la actividad metabólica mitocondrial y Ψm en miocitos cardíacos aislados de ratones wt de 10 a 15 semanas de edad, en respuesta a la activación del LTCC usando el agonista del canal BayK (-). La actividad metabólica depende del consumo de oxígeno y del transporte de electrones mitocondriales a lo largo de la cadena de transporte de electrones. Por lo tanto, medimos las alteraciones en el transporte de electrones mitocondriales en miocitos cardíacos intactos colocados en hidrogeles blandos y rígidos durante al menos 3 h, mediante el seguimiento de los cambios en la oxidación de flavoproteínas (como autofluorescencia). Encontramos que los miocitos naturales colocados en hidrogeles blandos y rígidos mostraron un aumento significativo en la oxidación de flavoproteínas después de la exposición a BayK(-) versus el enantiómero (+) de BayK que no actúa como agonista (BayK(+)) (Fig. 2a-c). Sin embargo, la magnitud de la respuesta de BayK (-) fue significativamente mayor en hidrogeles rígidos que en hidrogeles blandos. Es importante destacar que todas las respuestas inducidas por BayK (-) podrían atenuarse con la aplicación del antagonista de LTCC nisoldipino, lo que confirma que LTCC medió la respuesta. Estos datos indican que las alteraciones en la rigidez de la ECM son suficientes para alterar la regulación de la función mitocondrial por parte del LTCC.

Fluorescencia ratiométrica representativa de flavoproteína (a, b) y JC-1 (e, f) registrada a partir de miocitos cardíacos naturales sembrados en hidrogeles blandos y rígidos antes y después de la exposición a BayK(+) 10 μM o BayK(-) 10 μM en el ausencia o presencia de nisoldipina (15 μM, Nisol). Los estudios de JC-1 se realizaron en condiciones libres de calcio (0 mM de calcio). Las flechas indican la adición de medicamentos. Para confirmar que las señales eran de origen mitocondrial, se aplicó FCCP (50 μM) al final de cada experimento de flavoproteínas para aumentar la oxidación de flavoproteínas. Se aplicó NaCN (40 mM) al final de cada experimento JC-1 para colapsar Ψm. Fluorescencia general de flavoproteína (c) y JC-1 (d) para todos los miocitos (n) expuestos a fármacos como se indica, incluida la media ± SEM. Fluorescencia d – h, flavoproteína (d) y JC-1 (h) para miocitos cardíacos (n, en suspensión) aislados de ratones cTnI-G203S cardiomiopáticos y homólogos wt después de la exposición a BayK(+) o BayK(-) 10 μM17 . Toda la significación estadística determinada mediante las pruebas de Kruskal-Wallis o la prueba ANOVA de Browne-Forsythe y Welch (i).

Para examinar el efecto de la rigidez del sustrato en la comunicación estructural-funcional entre el canal y las mitocondrias, también evaluamos las alteraciones en Ψm en condiciones libres de calcio. Aunque la fosforilación oxidativa es un proceso dependiente del calcio, Ψm permanece altamente polarizado en condiciones de calcio intracelular bajo (0–535 nM)32,33. De hecho, los estudios realizados en miocitos cardíacos de ratón y cobaya demuestran que la activación del LTCC mediante pinzamiento de voltaje de la membrana plasmática, la aplicación de una solución con alto contenido de K+ o BayK(-), produce un aumento de Ψm, incluso en ausencia de calcio9 . La despolimerización de actina o β-tubulina con latrunculina A o colchicina, o la ausencia de distrofina, atenúa la Ψm elevada, lo que indica que la respuesta depende de una arquitectura citoesquelética intacta6,7,9,16. Aquí, de acuerdo con las alteraciones observadas en la oxidación de flavoproteínas, encontramos que los miocitos wt sembrados en hidrogeles blandos y rígidos, incubados durante al menos 3 h en HBS sin calcio y con EGTA, mostraron un aumento significativo en Ψm después de la aplicación de BayK (- ) versus BayK (+) (Fig. 2e-g). Una vez más, la magnitud de la respuesta de BayK (-) fue significativamente mayor en hidrogeles rígidos que en hidrogeles blandos. Todas las respuestas inducidas por BayK(–) fueron abolidas con nisoldipina, lo que confirma que el LTCC medió la respuesta. Estos datos indican que las alteraciones en la rigidez de la ECM son suficientes para alterar la comunicación estructural-funcional entre el LTCC y las mitocondrias.

Significativamente, las alteraciones en la actividad metabólica y Ψm observadas en miocitos wt colocados en hidrogeles rígidos versus blandos imitaron datos previos obtenidos de cTnI-G203S versus miocitos cardíacos wt (Fig. 2d, h)6,17. Estos datos indican que el aumento de la rigidez de la MEC puede contribuir a la progresión de la fisiopatología de la MCH.

Examinamos varios sitios "enlazadores" entre el LTCC y las mitocondrias como mediadores potenciales de la función mitocondrial en respuesta al aumento de la rigidez del sustrato. Descubrimos que los aumentos inducidos por BayK (-) tanto en la oxidación de flavoproteínas como en Ψm se atenuaron significativamente en miocitos wt colocados en hidrogeles blandos y rígidos en presencia de un péptido derivado específicamente contra el LTCC AID cardíaco que inmoviliza la subunidad β2 de LTCC (AID-TAT péptido, Fig. 1a) (Fig. 3a – f). Se observaron resultados similares en presencia de un péptido que se dirige al sitio de interacción entre la subunidad β2 de LTCC y AHNAK (AHNAK-P4N-TAT, Fig. 1a) (Fig. 3a-f). De manera similar, las alteraciones inducidas por BayK (-) tanto en la oxidación de flavoproteínas como en Ψm fueron abolidas en presencia de actina o agentes despolimerizantes de β-tubulina, Latrunculina A o colchicina, respectivamente (Fig. 3g-l). Estos datos confirman una red estructural-funcional clave entre el LTCC cardíaco y las mitocondrias a través de la red citoesquelética que regula la función mitocondrial en condiciones de rigidez alterada de la ECM.

Fluorescencia ratiométrica representativa de flavoproteína (a, b y g, h) y JC-1 (d, e y j, k) registrada a partir de miocitos cardíacos naturales sembrados en hidrogeles blandos y rígidos antes y después de la exposición a BayK (+) 10 μM, o BayK(-) 10 μM en ausencia o presencia de AID-TAT (10 μM), AHNAK-P4N-TAT (1 μM), latrunculina A (Latrunc, 5 μM, 20 min de preincubación) o colchicina (Colch, 1 μM, 3 h de preincubación51). Los estudios de JC-1 se realizaron en condiciones libres de calcio (0 mM de calcio). Las flechas indican la adición de medicamentos. Para confirmar que las señales eran de origen mitocondrial, se aplicó FCCP (50 μM) al final de cada experimento de flavoproteínas para aumentar la oxidación de flavoproteínas. Se aplicó NaCN (40 mM) al final de cada experimento JC-1 para colapsar Ψm. Fluorescencia general de flavoproteína (c e i) y JC-1 (f y l) para todos los miocitos (n) expuestos a fármacos como se indica, incluida la media ± SEM. Toda la significancia estadística determinada por las pruebas de Kruskal-Wallis.

Además de un vínculo intracelular entre el LTCC y las mitocondrias a través de la red citoesquelética, también parece existir una asociación estructural-funcional entre la ECM y la actina F a través de la integrina. Curiosamente, aquí encontramos que las alteraciones inducidas por BayK (-) tanto en la oxidación de flavoproteínas como en Ψm se atenuaron significativamente en miocitos naturales colocados en hidrogeles blandos y rígidos en presencia de un anticuerpo bloqueador de la función de la integrina β1 murina (CD-29, Fig. 1a ) (Figuras 4a-f). En general, estos datos sugieren que el LTCC cardíaco y la integrina pueden participar como socios en la mediación de la función mitocondrial en condiciones de rigidez de la MEC que imitan el fenotipo sano y de la MCH. Exploramos más a fondo esta red manipulando la rigidez intracelular. Descubrimos que la exposición de miocitos wt colocados en hidrogeles blandos y rígidos a jasplakinolida, un fármaco que estabiliza la actina F y, por lo tanto, endurece la red citoesquelética, fue suficiente para inducir un aumento significativo en la oxidación de flavoproteínas y Ψm (Fig. 4g-l). lo que indica un papel potencial de la rigidez del citoesqueleto en la regulación de la función mitocondrial en ambas condiciones. Estos hallazgos están respaldados por estudios que demuestran que las alteraciones en las proteínas citoesqueléticas son suficientes para influir en la función mitocondrial13,14,15.

Fluorescencia ratiométrica representativa de flavoproteína (a, b y g, h) y JC-1 (d, e y j, k) registrada a partir de miocitos cardíacos puros sembrados en hidrogeles blandos y rígidos antes y después de la exposición a 10 μM de BayK(+), Jasplakinolide. (Jasp, 1 μM, 20 min de preincubación), o 10 μM BayK(-) en ausencia o presencia de CD-29 (5 μg/ml, 30 min de preincubación). Los estudios de JC-1 se realizaron en condiciones libres de calcio (0 mM de calcio). Las flechas indican la adición de medicamentos. Para confirmar que las señales eran de origen mitocondrial, se aplicó FCCP (50 μM) al final de cada experimento de flavoproteínas para aumentar la oxidación de flavoproteínas. Se aplicó NaCN (40 mM) al final de cada experimento JC-1 para colapsar Ψm. Fluorescencia general de flavoproteína (c e i) y JC-1 (f y l) para todos los miocitos (n) expuestos a fármacos como se indica, incluida la media ± SEM. Toda la significancia estadística determinada por las pruebas de Kruskal-Wallis.

Exploramos la reversibilidad del estado mitocondrial hipermetabólico de cTnI-G203S que surge de la mutación de cTnI Gly203Ser, probando el efecto de reducir la rigidez del sustrato en Ψm y la actividad metabólica mitocondrial en miocitos cardíacos aislados de ratones cTnI-G203S con MCH establecida. Los ratones cTnI-G203S exhiben características distintivas de la MCH que incluyen hipertrofia e hipercontractilidad a partir de las 21 semanas de edad5,6,17,35. Por lo tanto, se colocaron miocitos cardíacos cTnI-G203S de 30 a 50 semanas de edad y miocitos cardíacos de la misma edad en hidrogeles rígidos y blandos durante al menos 3 h para imitar la MCH innata y las condiciones saludables, respectivamente. Luego se evaluaron las alteraciones en la rigidez celular y la función mitocondrial. De acuerdo con los datos recopilados de miocitos cardíacos de 10 a 15 semanas de edad, los miocitos de 30 a 50 semanas de edad colocados en hidrogeles rígidos mostraron un aumento significativo en la rigidez a la compresión en comparación con los hidrogeles blandos (p <0,05, Fig. 5a). Además, los miocitos cTnI-G203S de 30 a 50 semanas de edad colocados en hidrogeles blandos mostraron una disminución significativa en la rigidez a la compresión en comparación con los colocados en hidrogeles rígidos (p <0,05, Fig. 5a). Estos datos demuestran que la rigidez a la compresión de los miocitos cardíacos naturales puede manipularse para imitar la de los miocitos cTnI-G203S, y viceversa. De acuerdo con el fenotipo de HCM, se observaron respuestas exageradas en cTnI-G203S versus miocitos naturales cuando se colocaron en condiciones blandas o rígidas (Fig. 5a). Si bien no se observó ninguna alteración en la expresión de la lamina A o vinculina, la colocación de miocitos cTnI-G203S en hidrogeles blandos resultó en una disminución significativa en la expresión de la integrina β1 (Fig. 5b-g), lo que implica a la integrina como una proteína mecanosensora clave en los miocitos cTnI-G203S. .

a Rigidez a la compresión (en kPa) de miocitos cardíacos aislados de ratones cTnI-G203S cardiomiopáticos y sus homólogos en peso sembrados en hidrogeles blandos y rígidos, incluida la media ± SEM. b – g Imágenes representativas y puntos de datos cuantificados para miocitos cardíacos cTnI-G203S sembrados en hidrogeles rígidos y blandos teñidos para lámina A (b, c), vinculina (d, e) e integrina (f, g), incluida la media ± SEM . n = número de células, N = número de geles. Toda la significación estadística se determinó mediante las pruebas de Mann Whitney o mediante la prueba de Kruskal-Wallis (a).

También medimos las alteraciones en la actividad metabólica mitocondrial y Ψm en miocitos cardíacos aislados de ratones cTnI-G203S de 30 a 50 semanas de edad sembrados en hidrogeles rígidos y blandos, en respuesta a la activación del LTCC usando BayK (-). Descubrimos que los miocitos cTnI-G203S colocados en hidrogeles rígidos y blandos mostraron un aumento significativo en la oxidación de flavoproteínas y Ψm después de la exposición a BayK (-) versus BayK (+) (Fig. 6a-f). La magnitud de la respuesta de BayK(-) se redujo significativamente en hidrogeles blandos versus rígidos, lo que indica que la rigidez de la ECM juega un papel crítico en la regulación de las alteraciones en la función mitocondrial en la fisiopatología de cTnI-G203S. Todas las respuestas inducidas por BayK (-) podrían atenuarse con la aplicación de nisoldipina o AID-TAT (Fig. 6a-f), lo que confirma que una comunicación estructural-funcional entre LTCC y las mitocondrias media la respuesta. Además de esto, las alteraciones inducidas por BayK (-) en la oxidación de flavoproteínas y Ψm se atenuaron significativamente en presencia de CD-29, mientras que la aplicación de jasplakinolida sola fue suficiente para inducir aumentos significativos en la oxidación de flavoproteínas y Ψm (Fig. 6g-l). . En conjunto, estos datos sugieren que el LTCC cardíaco y la integrina pueden participar como socios en la mediación del estado mitocondrial hipermetabólico exhibido por los miocitos cTnI-G203S.

Flavoproteína ratiométrica representativa (a, byg, h) y JC-1 (d, e y j, k) miocitos cardíacos registrados con fluorescencia aislados de ratones cardiomiopáticos cTnI-G203S sembrados en hidrogeles rígidos y blandos antes y después de la exposición a BayK 10 μM (+), Jasplakinolide (Jasp, 1 μM, 20 min de preincubación) o BayK(-) 10 μM en ausencia o presencia de nisoldipina (15 μM, Nisol), AID-TAT (10 μM) o CD- 29 (5 µg/ml, 30 min de preincubación). Los estudios de JC-1 se realizaron en condiciones libres de calcio (0 mM de calcio). Las flechas indican la adición de medicamentos. Para confirmar que las señales eran de origen mitocondrial, se aplicó FCCP (50 μM) al final de cada experimento de flavoproteínas para aumentar la oxidación de flavoproteínas. Se aplicó NaCN (40 mM) al final de cada experimento JC-1 para colapsar Ψm. Fluorescencia general de flavoproteína (c e i) y JC-1 (f y l) para todos los miocitos (n) expuestos a fármacos como se indica, incluida la media ± SEM. Toda la significancia estadística determinada por las pruebas de Kruskal-Wallis.

Para investigar más a fondo el papel de LTCC y integrina β1 en la progresión de la enfermedad, evaluamos los niveles de expresión de LTCC y integrina β1 en homogeneizados de corazón completo recolectados de ratones cTnI-G203S pre y poscardiomiopáticos. No encontramos diferencias significativas en la expresión de LTCC en corazones cTnI-G203S pre y poscardiomiopáticos o en corazones wt de la misma edad (Fig. 7a, by Fig. Suplementaria 2). Sin embargo, se observaron alteraciones en la expresión de la integrina β1 en corazones cTnI-G203S pre y poscardiomiopáticos versus wt, y los aumentos más sustanciales se produjeron en corazones poscardiomiopáticos (Fig. 7c, d y Fig. 2 complementaria). En general, las alteraciones en la expresión de integrinas parecen "empeorar" tarde en la progresión de la enfermedad de MCH cTnI-G203S. Esto puede ser indicativo de un estado desadaptativo36.

Análisis de inmunotransferencia de la expresión de la proteína del canal de calcio tipo L (a, b) y de la integrina β1 (c, d) realizado en un homogeneizado de corazón total agrupado de grupos de 5 pacientes pre (10 a 15 semanas de edad) o poscardiomiopáticos (30 –50 semanas de edad) ratones cTnI-G203S y sus homólogos de la misma edad. Inmunotransferencias representativas sondadas con anticuerpo de la subunidad α1C del canal de calcio tipo L (CaV1.2, a) o de la integrina β1 (c), luego con el anticuerpo monoclonal GAPDH. Análisis de densitometría de la expresión de la proteína CaV1.2 (b) o integrina β1 (d), normalizada a la expresión de GAPDH asociada. n = número de repeticiones técnicas. Se determinó significación estadística mediante ANOVA de Browne-Forsythe y Welch (b) o Kruskal-Wallis (d). Análisis densitométrico de la expresión relativa de mTOR (calculada como Fosfo-mTOR/mTOR total) realizado en fracciones citoplasmáticas (e) y nucleares (f) agrupadas de grupos de cinco ratones cTnI-G203S pre o poscardiomiopáticos y sus homólogos de la misma edad. Se utilizaron anticuerpos β-tubulina e histona H2B como controles de carga para las fracciones citoplasmáticas y nucleares, respectivamente. n = número de repeticiones técnicas. Se determinó significación estadística mediante ANOVA de Browne-Forsythe y Welch (e) o Kruskal-Wallis (f). g Esquema que indica el vínculo estructural-funcional entre el canal de calcio tipo L, la red citoesquelética, las mitocondrias, la integrina y la matriz extracelular en miocitos cardíacos wt y cTnI-G203S. Una arquitectura citoesquelética alterada en los miocitos cardíacos cTnI-G203S puede desencadenar un mecanismo de retroalimentación desadaptativo entre el aumento de la rigidez de la matriz citoesquelética y extracelular, lo que resulta en un estado mitocondrial hipermetabólico.

El objetivo de la rapamicina (mTOR) en los mamíferos es una vía de señalización independiente del calcio, que es un regulador clave de la síntesis de proteínas, la biogénesis mitocondrial y el metabolismo celular, y se ha implicado en el desarrollo de la MCH37,38,39. Los miocitos aislados de ratones cTnI-G203S exhiben un aumento en el tamaño y la densidad mitocondrial en comparación con los miocitos naturales, pero ninguna alteración en la concentración de calcio intracelular2,3. Por lo tanto, aquí probamos la participación de mTOR en el desarrollo de la miocardiopatía cTnI-G203S. Antes del desarrollo de la patología cTnI-G203S se producen alteraciones en la actividad metabólica mitocondrial mediada por LTCC y un estado mitocondrial hipermetabólico resultante. Para determinar si las alteraciones en la expresión de proteínas ocurren temprano o tarde en la progresión de la enfermedad, evaluamos la expresión de mTOR en fracciones citoplásmicas y nucleares preparadas a partir de corazones de ratones cTnI-G203S pre y poscardiomiopáticos. La expresión de mTOR fosforilada (fosfo-mTOR) se normalizó a mTOR total para producir una expresión de mTOR "relativa" (consulte las figuras complementarias 3 y 4 para conocer los datos de fosfo-mTOR individual y mTOR total). Descubrimos que la expresión relativa de mTOR aumentó significativamente en las fracciones cTnI-G203S post- versus precardiomiopáticas y citoplasmáticas (Fig. 7e) y nucleares (Fig. 7f); apoyando la idea de que mTOR puede desempeñar un papel en el proceso de envejecimiento cardíaco "normal"37. Sin embargo, de manera notable, la expresión relativa de mTOR se elevó significativamente en las fracciones nucleares de cTnI-G203S pre y poscardiomiopáticas en comparación con sus contrapartes de la misma edad (Fig. 7f). Estos datos sugieren que la activación de mTOR también puede contribuir a la fase temprana de la enfermedad. Sin embargo, se necesitarían más estudios funcionales que utilicen las plataformas descritas en este estudio para confirmar el papel causal de mTOR en la progresión de la enfermedad.

Una “ruptura de comunicación” intracelular entre el LTCC y las mitocondrias contribuye a un estado mitocondrial hipermetabólico que surge de mutaciones en los genes de la cadena pesada de cTnI y β-miosina6,17,31. Estas respuestas preceden al desarrollo de la MCH. El aumento de la síntesis de proteínas de la MEC se ha implicado en la progresión de la patología de la MCH humana20,21,22. Aquí, utilizando una plataforma in vitro que imita la rigidez miocárdica de la MCH, demostramos que las alteraciones en la rigidez del sustrato pueden modular la comunicación estructural-funcional entre el LTCC y las mitocondrias. Esto parece ocurrir a través de sitios clave de "enlazador" dentro de la red citoesquelética, tanto en condiciones de salud como de MCH (Figs. 2 y 6). Con esto, proponemos que el aumento de la rigidez de la MEC, aguas arriba del LTCC, puede contribuir a la progresión de la fisiopatología de la MCH resultante de la mutación del gen Gly203Ser. En apoyo de esto, los tejidos cardíacos diseñados mediante la siembra de miocitos cardíacos derivados de células madre pluripotentes inducidas por seres humanos sanos en tiras de miocardio descelularizado extraídos de un modelo porcino de MCH exhiben una mayor rigidez21.

Encontramos que la inhibición de la proteína mecanosensora β1-integrina abolió las alteraciones inducidas por LTCC en la actividad metabólica mitocondrial, mientras que el aumento de la rigidez citoesquelética simuló alteraciones inducidas por LTCC en la función mitocondrial (Figs. 4 y 6). Curiosamente, el LTCC cardíaco y la integrina β1 son proteínas transmembrana que se asocian estructural y funcionalmente con la actina F12,23,25,26. Existe buena evidencia de que la mecanotransducción cardíaca ocurre tanto de adentro hacia afuera como de afuera hacia adentro40,41. Con esto, proponemos un mecanismo de retroalimentación entre la ECM y la red citoesquelética, a través de la integrina, que ayuda a regular las alteraciones en la función mitocondrial mediada por LTCC en condiciones saludables, pero se vuelve desadaptativo en respuesta a la mutación del gen sarcomérico Gly203Ser, participando así en la progresión de la Estado de la enfermedad MCH (Fig. 7g). Para evaluar el efecto de las alteraciones en la rigidez del sustrato sobre la regulación de la función mitocondrial por parte del LTCC en condiciones tanto saludables como de HCM, todos los estudios en este artículo se realizaron en miocitos cardíacos inactivos. Además, para explorar el papel regulador metabólico del vínculo estructural-funcional entre el LTCC y las mitocondrias, se realizaron alteraciones en Ψm en condiciones libres de calcio. Se necesitarían estudios futuros que involucren mediciones de la contractilidad para dilucidar aún más el papel de la rigidez de la ECM en los mecanismos identificados en este estudio.

Los estudios genéticos han identificado más de 1500 mutaciones diferentes en el gen sarcómero asociadas con el desarrollo de HCM4. Una revisión de estudios que investigan la fisiopatología de la MCH reveló que, si bien existen algunas similitudes, cada mutación parece conducir a una fisiopatología específica de la mutación42. Por lo tanto, se necesitaría más investigación para confirmar la participación del mecanismo propuesto en el desarrollo de MCH específica que causa mutaciones en el gen sarcomérico. Desde una perspectiva terapéutica, el tratamiento de ratones cTnI-G203S con AID-TAT restaura la cinética de LTCC, la actividad metabólica mitocondrial y previene el desarrollo de hipertrofia17. Otros estudios que implican análisis proteómicos del tejido cardíaco de pacientes con MCH con mutaciones genéticas sarcoméricas identificadas sugieren la red de microtúbulos como un posible objetivo de tratamiento43. Estos hallazgos respaldan la idea de que abordar las respuestas celulares posteriores a la rigidez de la MEC puede ser una consideración importante en el desarrollo de terapias preventivas44. Con una caracterización adicional, los sitios 'enlazadores' clave entre el LTCC y las mitocondrias y/o las proteínas sarcoméricas modificadoras pueden representar objetivos terapéuticos potenciales para el desarrollo de enfoques de tratamiento de la MCH para pacientes con mutaciones genéticas sarcoméricas identificadas.

Los hidrogeles de poliacrilamida (PA) se fabricaron según un método descrito anteriormente45. Se elaboraron soluciones prepolímeras para hidrogeles que imitan el miocardio sano (blando) y HCM (rígido) combinando acrilamida (Bio-Rad), bis-acrilamida (Bio-Rad), PBS de Dulbecco (libre de Mg2+ y Ca2+) (Life Technologies) y H2O desionizada (consulte la Tabla 1 para ver la receta). Los cubreobjetos se limpiaron y activaron en un limpiador de ozono durante 1 minuto en cada lado (Bioforce Nanosciences UV/Ozone ProCleaner), luego se funcionalizaron durante 5 minutos en una solución que contenía metacrilato de 3-(trimetoxisilil)propilo (0,5% V/V) (Merck). , ácido acético glacial (3% V/V) y etanol puro (96,5% V/V). Los cubreobjetos funcionalizados se enjuagaron en etanol durante 1 minuto y se dejaron secar al aire, luego se recubrieron con dimetildiclorosilano (DCDMS) para crear una superficie plana y no adhesiva para fabricar hidrogeles. Luego se preparó una solución de polímero agregando 10 µl de persulfato de amonio (APS) (Bio-Rad) y 1 µl de N,N,N′,N′-tetrametiletilendiamina (TEMED) (Bio-Rad) a 1 ml de pre- solución de polímero. A continuación, se pipetearon 4 o 12 µl de solución de polímero sobre portaobjetos de vidrio recubiertos con DCDMS para lograr una altura final de 50 µm (para cubreobjetos redondos de 10 mm de diámetro o cuadrados de 15 × 15 mm2, respectivamente). Luego se colocaron suavemente cubreobjetos funcionalizados encima. Se permitió que los hidrogeles polimerizaran durante 20 minutos antes de retirar los cubreobjetos de los portaobjetos recubiertos con DCDMS y esterilizarlos con luz UV.

Los hidrogeles se enjuagaron tres veces en tampón de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) (50 mM, pH 8,5) (Life Technologies), luego se sumergieron en N-sulfosuccinimidil-6-(4′-azido-2 ′-nitrofenilamino) hexanoato (sulfo-SANPAH; Thermo Scientific) en HEPES (1 mg/ml). Se activó Sulfo-SANPAH bajo luz UV (365 nm, 10 min), luego se eliminó y los hidrogeles se enjuagaron en HEPES. Luego se sumergieron los hidrogeles en laminina de ratón (ThermoFisher 23017015) en HEPES (25 µg/ml) y se incubaron durante la noche a 37 ˚C. Antes de su uso, los hidrogeles se enjuagaron con PBS para eliminar la laminina no unida.

Se utilizó microscopía de fuerza atómica (AFM) para medir la rigidez a la compresión de hidrogeles y células individuales, medida en módulos de Young. Las mediciones se realizaron con un microscopio de fuerza atómica MFP-3D (Asylum Research), utilizando voladizos de nitruro de pyrex recubiertos de cromo/oro de 200 µm con puntas de forma triangular (Nano World modelo PNP-TR). Las mediciones se realizaron en PBS 1× (libre de Mg2+ y Ca2+) y se sondaron con muescas de 2 nN (velocidad de aproximación: 2 µm/s, velocidad de retracción: 10 µm/s). La porción lineal de la curva de fuerza generada por el contacto se utilizó para determinar el módulo de Young mediante un código personalizado en Igor Pro, como se describió anteriormente46. Las indentaciones se hicieron por triplicado para garantizar la estabilidad de las mediciones y se promediaron para dar una rigidez promedio por indentación. Se eligieron al azar seis puntos de cada hidrogel para sangrarlos. El promedio de estas seis indentaciones se utilizó como estimación de la rigidez a la compresión general del hidrogel47. Se caracterizaron dos repeticiones técnicas por repetición biológica para garantizar que los hidrogeles tuvieran una rigidez constante. La rigidez de las células se caracterizó por sangrar el centro de las células individuales. Se sangraron aproximadamente 28 células por repetición biológica27,48. Para la rigidez de una sola célula, se realizaron cuatro repeticiones técnicas por repetición biológica. Se realizaron un mínimo de cuatro repeticiones biológicas por condición.

La línea celular de mioblastos H9C2, aislada de tejido ventricular de rata, fue suministrada por la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC, Salisbury, Reino Unido) y adquirida en CellBank Australia (Westmead, NSW, número de catálogo 88092904). Las células H9C2 se cultivaron según las instrucciones de ECACC. Las células se reanimaron en medio de crecimiento completo compuesto por medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, alto contenido de glucosa, piruvato, ThermoFisher), suplementado con glutamina 4 mM y suero de ternera fetal al 10%. Las células se sembraron a razón de 1 a 3 x 10.000 células/cm2. Los cambios de medios se realizaron una vez cada 2 a 3 días. El subcultivo se realizó en una confluencia de ~70-80%. Para subcultivar o colocar en placas sobre hidrogeles de PA, se eliminó y descartó el DMEM, se reemplazó con tripsina-EDTA al 0,25 % (ThermoFisher) y se incubó durante aproximadamente 3 min (37 °C) antes de centrifugar la suspensión celular a 1200 rpm (5 min). Luego se eliminó el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en medio de crecimiento completo precalentado. Para los hidrogeles de PA, las células se sembraron en placas con 10.000 células por hidrogel (blando o rígido) y se incubaron durante 24 a 48 h a 37 ° C antes de la experimentación.

Se utilizaron ratones macho para todos los estudios. Se utilizaron miocitos cardíacos adultos aislados de ratones que expresan el gen cTnI humano que codifica la mutación cTnI-G203S causante de HCM humana. Los ratones desarrollan características distintivas de la MCH a las 21 semanas5,6,17,35. Se utilizaron ratones cTnI-G203S de 10 a 15 semanas de edad (precardiomiopáticos) y de 30 a 50 semanas (poscardiomiopáticos) para estudios in vitro y ex vivo. Se utilizaron como controles (peso) ratones de la misma edad que expresaban el gen cTnI humano normal. Se utilizaron ratones macho para eliminar posibles diferencias en las respuestas debidas al sexo. Los experimentos se realizaron en un total de setenta y cuatro ratones wt de 10 a 15 semanas de edad, diez ratones cTnI-G203S de 10 a 15 semanas de edad, dieciséis ratones wt de 30 a 50 semanas de edad y cuarenta y cinco ratones de 30 a 50 semanas de edad. Ratones cTnI-G203S de 50 semanas de edad. Todos los animales fueron asignados aleatoriamente a grupos de tratamiento. Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Australia Occidental de acuerdo con el Código de prácticas australiano para el cuidado y uso de animales con fines científicos (NHMRC, octava edición, 2013).

Se aislaron miocitos cardíacos adultos de ratones wt y cTnI-G203S como se describió anteriormente16,17,49. Los ratones se anestesiaron con pentobarbitona sódica (240 mg/kg, mediante inyección intraperitoneal), luego se extirparon los corazones y se canularon en un aparato de Langendorff a través de la aorta. Los corazones se perfundieron con tampón Krebs-Henseleit (KHB) que contenía (en mM): 120 NaCl, 25 NaHCO3, 4,8 KCl, 2,2 MgSO4, 1,2 NaH2PO4 y 11 glucosa (pH = 7,35 con O2/CO2 a 37 °C) para: 4 min a 37 °C, luego 3 min en presencia de 2,4 mg/ml de colagenasa B, luego 8 min en presencia de calcio 40 μM. Después de la perfusión, el tejido ventricular se separó y se trituró para disociar los miocitos en suspensión. La suspensión de miocitos se dejó reposar durante 20 minutos, se descartó el sobrenadante y los miocitos se resuspendieron en una solución tamponada con Hepes (HBS) libre de calcio que contenía (en mM): 5,3 KCl, 0,4 MgSO4·7H2O, 139 NaCl, 5,6 Na2HPO4·2H2O, 5 glucosa. , 20 Hepes y 2 glutamina (pH = 7,4 a 37 °C) en presencia o ausencia de EGTA 3 mM (para experimentos de calcio 0 mM). Para los experimentos que contenían calcio, el calcio se volvió a titular para lograr una concentración extracelular final de 1,8 mM. Las suspensiones de miocitos se sembraron en hidrogeles y se incubaron durante al menos 3 h a 37 °C antes de la experimentación. Todos los estudios in vitro se realizaron en miocitos inactivos recién aislados a 37 °C.

Las células se prepararon para imágenes confocales según los métodos descritos previamente7,16. Después del cultivo en placas y la incubación, las células H9C2 o miocitos cardíacos adultos se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), que contenía en mM: 13 KCl, 7,35 KH2PO4, 0,69 NaCl, 40,4 y 40,4 Na2HPO4 · 7H2O (pH = 7,4), luego se fijaron. con paraformaldehído al 4% (PFA, en PBS, durante 15 min), y permeabilizado con Triton X-100 al 0,3% (15 min). Después de la permeabilización, las células se incubaron en una solución de bloqueo que contenía un 5% de suero de cabra y un 5% de suero de caballo (en PBS) durante 1 hora a 37 °C. Luego, las células se incubaron con anticuerpos primarios lámina A (1:400, Abcam, ab26300) y vinculina (1:200, Abcam, ab130007) en BSA al 5% (en PBS, 1 h a 37 °C). Luego, las células se incubaron con rodamina faloidina (TRITC, 1:400, ThermoFisher, R415), IgG H&L anti-conejo de cabra F(ab) (FITC, 1:200, Abcam ab7050) y IgG H&L anti-ratón de cabra (Alexa Fluor® 647, 1:200, Abcam ab150115) en BSA al 5% (en PBS, 1 h a 37 °C). Alternativamente, las células se incubaron con un anticuerpo primario de integrina β1 (1:100, ThermoFisher MA1-06906) en BSA al 5 % (en PBS, 1 h a 37 °C), seguido de IgG H&L anti-ratón de cabra (Alexa Fluor® Plus 488, 1:400, ThermoFisher A32723) en BSA al 5% (en PBS, 1 h a 37 °C). Finalmente, las células se incubaron con tinción de ácido nucleico DAPI (1:200 en PBS, Sigma-Aldrich D9542) durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de montarlas en portaobjetos de vidrio para obtener imágenes. Se tomaron imágenes de las células en un microscopio fluorescente invertido Olympus IX71 con un aumento de 60 ×.

El yoduro de 5,5 ′,6,6′-tetracloro-1,1 ′,3,3′-tetraetilbencimidazolilcarbocianina (JC-1) se adquirió de Molecular Probes (Eugene, Oregon, EE. UU.). El cianuro de carbonilo-4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP), la colchicina, latrunculina A, la nisoldipina, (S)-(-)-Bay K8644 (BayK(-)) y el cianuro de sodio (NaCN) se compraron a Merck (Kenilworth, Nueva York). Jersey, Estados Unidos). La jasplakinolida se adquirió de Cayman Chemical (Ann Arbor, Michigan, EE. UU.); (R)-(+)-Bay K8644 (BayK(+)) de BioVision (Milpitas, California, EE.UU.); y CD-29 de BD Biosciences (Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.). El péptido AID-TAT se sintetizó utilizando la secuencia de aminoácidos QQLEEDLKGYLDWITQAE, incluida una secuencia TAT que penetra en las células (RKKRRQRRR) unida mediante ácido 6-aminohexanoico (AusPep, Tullamarine, Victoria, AUS)50. El péptido AHNAK-P4N-TAT se sintetizó utilizando la secuencia de aminoácidos KGKHGKLKFGTFGGLGSKSKGHYEVT unida a la secuencia TAT como se describió anteriormente (Mimotopes Pty Ltd, Victoria, AUS).

El potencial de membrana mitocondrial (Ψm) se evaluó utilizando el indicador fluorescente JC-1 (200 nM, período de incubación = 3 h, ex = 480 nm, em = 580/535 nm, intervalo = 2 min, exposición = 50 ms)16,17. Al final de cada experimento, se aplicó cianuro de sodio, un bloqueador del transporte de electrones mitocondrial, para colapsar Ψm, lo que confirma que la señal de JC-1 era indicativa de Ψm (NaCN, 40 mM). La oxidación de flavoproteínas mitocondriales se evaluó registrando la autofluorescencia de los miocitos como se describió anteriormente (ex = 480 nm, em = 535 nm, intervalo = 1 min, exposición = 250 ms)16,17. Se añadió el desacoplador de la cadena de transporte de electrones mitocondrial FCCP (50 μM) al final de cada experimento para aumentar la oxidación de flavoproteínas, lo que confirma que la señal era de origen mitocondrial. Toda la fluorescencia in vitro se midió en una cámara Andor Zyla SCMOS de 5,5 MP conectada a un microscopio Nikon TE2000-U invertido. Las imágenes radiométricas fluorescentes de flavoproteína o JC-1 se cuantificaron utilizando Metamorph 7.10. Las regiones que contenían miocitos se rastrearon manualmente para obtener una señal fluorescente para cada célula. Se usó como fondo una región equivalente que no contenía células y se restó para cada celda. Las respuestas a los tratamientos se informaron como un aumento o disminución porcentual respecto del promedio (basal) previo al tratamiento.

La concentración de proteína de todas las muestras se cuantificó mediante el ensayo de proteína de Bradford utilizando BSA como estándar. Se cargaron muestras de 25 µg en gel de poliacrilamida SDS BIO-RAD Mini-PROTEAN® TGX Stain-FreeTM al 10% prefabricado (Bio-RAD Laboratories), luego se transfirieron electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa de 0,2 µm (Trans-Blot® TurboTM Transfer Pack, Bio- RAD Laboratories) utilizando el sistema de transferencia Bio-RAD Trans-Blot® TurboTM. Las transferencias se eliminaron entre cada paso de nuevo sondeo utilizando un tampón de extracción, que consiste en (en mM): Tris HCl pH 6,8: 62,5, 2-mercaptoetanol: 100, SDS al 2 %, 30 min a 50 °C). La densitometría cuantitativa se realizó en imágenes capturadas utilizando un sistema de imágenes Chemidoc (Bio-rad) y el software ImageJ. Los datos se presentan como densidad óptica de expresión de proteínas, normalizada con respecto al control de carga detectado en la misma transferencia.

El análisis de inmunotransferencia se realizó en un homogeneizado de corazón total agrupado a partir de grupos de cinco ratones wt y cTnI-G203S de 10 a 15 semanas y de 30 a 50 semanas de edad. Brevemente, se pesaron corazones congelados, se molieron hasta obtener un polvo fino en N2 líquido usando un mortero y se homogeneizaron en tampón RIPA 1:4 que consistía en (en mM): NaCl 150, Tris 50, Na4P2O7 20, Na3VO4 2, NaF. 1, desoxicolato de sodio al 0,5 %, Triton X-100 al 1 %, SDS al 0,1 %, pH 7,4, suplementado con cOmplete™, Mini, proteasa sin EDTA (Roche, 4693159001) y fosfatasa PhosStopTM (Roche, 4906837001, dilución 1:100 ) tabletas inhibidoras. Luego se centrifugó el homogeneizado total del corazón a 10.000 g durante 5 minutos a 4 °C. Las transferencias se sondaron con los siguientes anticuerpos primarios: anti-CaV1.2 policlonal de conejo (Alomone, ACC-003, 1:200) o integrina anti-β1 monoclonal de conejo (D6S1W) (Cell Signaling Technology 34971, 1:1000). Se utilizó anti-GAPDH monoclonal de conejo (Cell Signaling Technology, 2118, 1:1000) como control de carga. Luego, las transferencias se sondaron con anticuerpo secundario policlonal anti-conejo IgG H&L (HRP) preabsorbido (Abcam, ab97080, 1:10,000).

Se prepararon fracciones subcelulares a partir de grupos de cinco corazones wt y cTnI-G203S de 10 a 15 semanas y de 30 a 50 semanas de edad, un kit de extracción nuclear y citoplasmática NE-PERTM (ThermoFisher Scientific, 78833), complementado con cOmplete™. , Mini, comprimidos inhibidores de Proteasa sin EDTA (Roche, 4693159001) y PhosStopTM fosfatasa (Roche, 4906837001), según protocolos del fabricante. Las transferencias se sondaron con los siguientes anticuerpos primarios: mTOR total, mAb de conejo mTOR (7C10) (Cell Signaling Technology, 2983, 1:1000); mTOR activo, fosfo-mTOR (Ser2448) (D9C2) XP® Rabbit mAb (Cell Signaling Technology, 5536, 1:1000); SRP6 total, mAb de conejo de proteína ribosomal S6 (5G10) (Cell Signaling Technology, 2217, 1:1000); SRP6 activo, proteína ribosomal fosfo-S6 (Ser235/236) (2F9) mAb de conejo (Cell Signaling Technology, 4856, 1:1000). Se usaron los siguientes anticuerpos primarios para los controles de carga: anticuerpo β-tubulina (Cell Signaling Technology, 2146, 1:500); mAb de conejo histona H2B (D2H6) (Cell Signaling Technology, 12364, 1:1000). Las transferencias se sondaron con anticuerpo secundario preadsorbido IgG H&L (HRP) anti-conejo de cabra (Abcam, ab97080, 1:10000). Se utilizaron los mismos anticuerpos para confirmar la pureza de las fracciones citoplasmáticas y nucleares (Figura complementaria 5).

Especies: H, M, R; Aplicaciones: BM, ICC, IF, IFC, IHC, IP; Validado por Alomone. Cita: 124 (https://www.alomone.com/p/anti-cav1-2-antibody/ACC-003). Integrina anti-β1 monoclonal de conejo (D6S1W, Cell Signaling Technology, 34971): Especies: H, M, R; Aplicaciones: WB, IHC; Validado por tecnología de señalización celular. Cita: 31 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/integrin-b1-d6s1w-rabbit-mab/34971). Anti-GAPDH monoclonal de conejo (Cell Signaling Technology, 2118): Especies: H, M, R, Mk, B, Pg; Aplicaciones: WB, IHC, IF, F; Validado por tecnología de señalización celular. Cita: 5360 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/gapdh-14c10-rabbit-mab/2118). mTOR total (mTOR) (7C10, mAb de conejo, Cell Signaling Technology, 2983): Especies: H, M, R, Mk; Aplicaciones: WB, IP, IHC, IF, F; Validado por tecnología de señalización celular. Cita: 1837 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/mtor-7c10-rabbit-mab/2983). mTOR activo (fosfo-mTOR) (Ser2448, D9C2, XP® Rabbit mAb, Cell Signaling Technology, 5536): Especies: H, M, R, Mk; Aplicaciones: WB, IP, IF; Validado por tecnología de señalización celular. Cita: 1356 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/phospho-mtor-ser2448-d9c2-xp-rabbit-mab/5536). SRP6 total (proteína ribosomal S6, 5G10, mAb de conejo, Cell Signaling Technology, 2217): Especies: H, M, R, Mk; Aplicaciones: WB, IHC, IF; Validado por tecnología de señalización celular. Cita: 1610 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/s6-ribosomal-protein-5g10-rabbit-mab/2217). SRP6 activo (proteína ribosómica fosfo-S6, Ser235/236, 2F9, mAb de conejo, Cell Signaling Technology, 4856): Especies: H, M, R, Mk; Aplicaciones: WB, IF, F; Validado por tecnología de señalización celular. Cita: 255 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/phospho-s6-ribosomal-protein-ser235-236-2f9-rabbit-mab/4856). Anticuerpo β-tubulina (Cell Signaling Technology, 2146): Especies: H, M, R, Mk, Z, B; Aplicaciones: WB, IHC, IF, F; Validado por tecnología de señalización celular. Cita: 676 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/b-tubulin-antibody/2146). Histona H2B (D2H6, mAb de conejo, Cell Signaling Technology, 12364): Especies: H, M, R, Mk; Aplicaciones: WB, IHC, ChiP; Validado por tecnología de señalización celular. Cita: 33 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/histone-h2b-d2h6-rabbit-mab/12364).

Los resultados se informan como media ± SEM. Para los datos no paramétricos, se aceptó significación estadística en P < 0,05 utilizando la prueba de Mann Whitney (bilateral) o la prueba de Kruskal-Wallis (unidireccional) para comparaciones múltiples. Para los datos paramétricos, se aceptó significación estadística en P <0,05 utilizando una prueba ANOVA de Brown-Forsythe y Welch (unidireccional) (GraphPad Prism versión 9.1.2). El número de réplicas y las comparaciones estadísticas se especifican en cifras.

Se utilizó el software Power and Sample Size (PS) para determinar el tamaño de la muestra teniendo en cuenta la variabilidad entre animales y la variabilidad intraanimal. Con esto, se determinó que sería necesario estudiar las respuestas en 10 ratones de cada cepa/genotipo de ratón para rechazar la hipótesis nula de que las medias poblacionales de los grupos experimentales son iguales con probabilidad/potencia de 0,95 (probabilidad de error tipo I = 0,05). Es de destacar que los valores de p resultantes de todos los datos in vitro oscilaron entre p <0,0001 y p <0,0216, lo que indica que los tamaños de muestra utilizados fueron suficientes para superar el nivel de significancia establecido.

No se excluyeron datos obtenidos de células vivas. Todos los intentos de replicación en células vivas tuvieron éxito. Para los estudios in vitro, se realizaron experimentos que implicaban el uso de diferentes agonistas/antagonistas a lo largo de diferentes días experimentales, de forma aleatoria. Además, dos personas realizaron experimentos simultáneamente en dos configuraciones experimentales fluorescentes diferentes. Un individuo estaba al tanto de los agonistas/antagonistas que se estaban aplicando para garantizar que se aplicaran los agentes correctos en el orden correcto. El otro individuo estaba cegado. Los datos se replicaron de manera confiable entre individuos en todos los casos.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y el archivo de información complementaria). Los datos de origen se pueden obtener en el archivo de datos suplementarios.

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Agradecemos la asistencia técnica de la Sra. Sarah Wong en la adquisición y procesamiento de los datos de inmunotransferencia mTOR. Subvención para proyectos APP1143203 (HMV) del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud de Australia. Subvención para proyectos APP1098449 (YSC) del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud de Australia. Beca de investigación senior del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud de Australia APP1117366 (LCH). Beca para futuros líderes de la Heart Foundation of Australia 101930 (HMV). Beca para futuros líderes de Heart Foundation Australia 101173 (YSC). Beca del Programa de Capacitación en Investigación del Gobierno de Australia (ILC). Beca para investigadores del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud de Australia APP1173015 (DS).

Facultad de Ciencias Humanas, Universidad de Australia Occidental, Crawley, WA, Australia

Helena M. Viola, Caitlyn Richworth, Tanya Solomon, Ian L. Chin, Henrietta Cserne Szappanos, Yu Suk Choi y Livia C. Hool

La Universidad Nacional de Australia, Canberra, ACT, Australia

Srinivasan Sundararaj, Dmitry Shishmarev y Marco G. Casarotto

Instituto de Investigación Cardíaca Victor Chang, Sydney, NSW, Australia

Livia C.Hool

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Conceptualización: HMV, LH Curación de datos: HMV, CR, TS, ILC, HCS, SS, DS Análisis formal: HMV, ILC, YSC, HCS, SS, DS Investigación: HMV, CR, TS, ILC, HCS, SS, DS Metodología: HMV, YSC Administración de proyectos: HMV Supervisión: HMV, YSC, HCS, MC, LH Validación: HMV, YSC, MC Visualización: Escritura HMV—Preparación del borrador original: Escritura HMV—Revisión y edición: HMV, CR, TS, ILC , YSC, HCS, SS, DS, MC, LH

Correspondencia a Helena M. Viola o Livia C. Hool.

MC, SS, DS y LH son inventores en la patente presentada (Número de solicitud australiana 2021900252). Todos los demás autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Nicholas Kurniawan y Christina Karlsson Rosenthal.

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Viola, HM, Richworth, C., Solomon, T. et al. Un mecanismo de retroalimentación desadaptativo entre la matriz extracelular y el citoesqueleto contribuye a la fisiopatología de la miocardiopatía hipertrófica. Común Biol 6, 4 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04278-9

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Recibido: 22 de febrero de 2022

Aceptado: 17 de noviembre de 2022

Publicado: 03 de enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04278-9

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